Dissertação

Development of new strategies for the purification of Burkholderia cenocepacia outer membrane vesicles (OMVs) EVALUATED

As vesículas da membrana externa (OMVs), segregadas por bactérias Gram-negativas, são estruturas esféricas de duas camadas, com um diâmetro variável entre 20-250 nm, ricas em lipopolissacarídeos (LPS), fosfolípidos e proteínas da membrana externa. As OMVs de Burkholderia cenocepacia purificadas têm mostrado potencial para aplicação em vacinas e na terapia antibiótica para a Fibrose Quística (FQ). Actualmente, os processos de downstream são baseados em métodos de centrifugação diferencial. Estes métodos apresentam baixos rendimentos, custos elevados e difícil aumento de escala. Este estudo focou-se no desenvolvimento de novas estratégias para a separação de OMVs das principais impurezas: o pili e os flagelos. Foram produzidas OMVs de uma estirpe de Burkholderia cenocepacia de baixo rendimento, sendo concentradas no sobrenadante através de uma ultrafiltração e sedimentadas por ultracentrifugação. Com vista a sua purificação, foram testadas várias alternativas começando com a triagem de sistemas de duas fases aquosas (ATPS) com PEG-Dextran, seguido do uso de PEG e um sal (sulfato de amónio/fosfato de potássio). A possibilidade de separar as OMVs através da sua carga negativa foi investigada como método alternativo, utilizando-se uma plataforma monolítica de aminas quaternárias. Foram também realizados testes usando a cromatografia de exclusão molecular (SEC) com diferentes resinas comercialmente disponíveis, tendo-se revelado um método eficaz. O uso de uma matrix de dextrano-poliacrilamida (Sephacryl) permitiu atingir os melhores resultados de purificação.
vesículas da membrana externa, processos de purificação, sistemas de duas fases aquosas, cromatografia de exclusão molecular, cromatografia monolítica.

Dezembro 14, 2015, 12:0

Publicação

Obra sujeita a Direitos de Autor

Orientação

ORIENTADOR

Dalila Madeira Nascimento Mil-Homens

iBB - Instituto de Bioengenharia e Biociências / Instituto Superior Técnico

Doutora

ORIENTADOR

Ana Margarida Nunes da Mata Pires de Azevedo

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Colaborador Não Remunerado Docente