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Dissertação

Development of new strategies for the purification of Burkholderia cenocepacia outer membrane vesicles (OMVs) EVALUATED

Detalhes: As vesículas da membrana externa (OMVs), segregadas por bactérias Gram-negativas, são estruturas esféricas de duas camadas, com um diâmetro variável entre 20-250 nm, ricas em lipopolissacarídeos (LPS), fosfolípidos e proteínas da membrana externa. As OMVs de Burkholderia cenocepacia purificadas têm mostrado potencial para aplicação em vacinas e na terapia antibiótica para a Fibrose Quística (FQ). Actualmente, os processos de downstream são baseados em métodos de centrifugação diferencial. Estes métodos apresentam baixos rendimentos, custos elevados e difícil aumento de escala. Este estudo focou-se no desenvolvimento de novas estratégias para a separação de OMVs das principais impurezas: o pili e os flagelos. Foram produzidas OMVs de uma estirpe de Burkholderia cenocepacia de baixo rendimento, sendo concentradas no sobrenadante através de uma ultrafiltração e sedimentadas por ultracentrifugação. Com vista a sua purificação, foram testadas várias alternativas começando com a triagem de sistemas de duas fases aquosas (ATPS) com PEG-Dextran, seguido do uso de PEG e um sal (sulfato de amónio/fosfato de potássio). A possibilidade de separar as OMVs através da sua carga negativa foi investigada como método alternativo, utilizando-se uma plataforma monolítica de aminas quaternárias. Foram também realizados testes usando a cromatografia de exclusão molecular (SEC) com diferentes resinas comercialmente disponíveis, tendo-se revelado um método eficaz. O uso de uma matrix de dextrano-poliacrilamida (Sephacryl) permitiu atingir os melhores resultados de purificação.
Keywords: vesículas da membrana externa, processos de purificação, sistemas de duas fases aquosas, cromatografia de exclusão molecular, cromatografia monolítica.

Discussão: dezembro 14, 2015, 12:0