Dissertação

Reconstitution of Ion Channels in a Lipid Bilayer in a Microfluidic Device using Cell-Free Protein Synthesis EVALUATED

A classe de proteínas transmembranares, canais iónicos, desempenha um papel crucial no controlo de vários processos fisiológicos. As mutações em genes que codificam estes canais provocam a alteraçãoao da sua função, resultando muitas vezes em doenças, o que os transformou em alvos muito atraentes para o desenvolvimento de novas drogas. No entanto, a expressão e purificação de canais iónicos tem sido um desafio. A cell-free protein synthesis (CFPS) emergiu nos últimos anos como uma alternativa promissora para ultrapassar as limitações associadas aos sistemas celulares. Além disso, não existe actualmente disponível, uma plataforma autónoma, de alto rendimento e conteúdo informativo para testar novos fármacos. Por esta razão, as plataformas miniaturizadas para membranas de bicamada lipídica (MBLs) têm despertado muito interesse. Neste contexto, este trabalho tem como objectivo expressar canais iónicos, nomeadamente o canal de potássio KcsA e a bacteriorodopsina (bR), utilizando um sistema CFPS e sua posterior caracterização eletrofisiológica num dispositivo microfluídico MBL. As proteínas alvo foram expressas em sistemas de CFPS utilizando um extracto optimizado de E. coli e na presença de nanolipoproteinas (NLPs). A expressão da bR foi observada num gel de SDS-PAGE. No entanto, para o KcsA os resultados do gel não foram conclusivos. O procedimento ineficiente de purificação não permitiu a obtenção de amostras adequadas para registros eletrofisiológicos. Assim, os resultados deste trabalho experimental indicam que existe a necessidade de rever o protocolo utilizado para a expressão das proteínas alvo no sistema CFPS e também investigar outros métodos de análise e purificação dos produtos de CFPS.
Canais iónicos, Canal KcsA; Bacteriorrodopsina, Cell-free protein synthesis, Membranes de bicamada lipídica

Julho 1, 2015, 10:0

Publicação

Obra sujeita a Direitos de Autor

Orientação

ORIENTADOR

Séverine Le Gac

University of Twente

Associate Professor

ORIENTADOR

Gabriel António Amaro Monteiro

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Professor Auxiliar