Dissertação

Production of recombinant human xanthine oxidase in E. coli and optimization of its application for preparative synthesis of oxidized drug metabolites EVALUATED

A enzima recombinante humana Xantina Oxidorreductase (XOR) foi expressa em Escherichia coli BL21(DE3) Gold. Esta enzima é conhecida pela sua capacidade oxidativa de compostos aromáticos que contêm azoto assim como por ser responsável pelos últimos passos da via de degradação de purinas. Vários métodos de ruptura celular foram testados assim como várias condições de cultura e de biotransformação. A expressão da enzima também foi optimizada através do uso de dois genes diferentes que codificam a XOR e pela co-expressão de chaperonas. O gene optimizado para expressão em E. coli (EcXO) sem a co-expressão de chaperonas provou ser a melhor opção. Das diferentes condições de cultura foi possível observar que meios pobres em nutrientes, tal como Lysogeny Broth (LB), levavam a valores de actividade específica mais elevados. A adição de lactose teve como consequência a total perda de actividade pelo que não foi utilizado nenhum indutor. Para além de frascos agitados, um fermentador foi utilizado para produzir XOR até culturas de 25 L. A última fermentação resultou num aumento de 5 vezes na actividade de XOR. Os métodos de ruptura celular não foram eficientes uma vez que a enzima usada sob a forma de suspensão celular levou a melhores resultados. XOR mostrou-se resistente à maioria dos solventes orgânicos testados. Quinazoline foi o substrato escolhido para a biotransformação à escala preparativa, dos 11 testados. XOR foi capaz de metabolizar 4 dos substratos estudados. A biotransformação de 100 mg de quinazolina resultou em 73 mg do produto de oxidação, após purificação.
Xantina Oxidorreductase, metabolismo oxidativo, biotransformação, optimização

Novembro 18, 2013, 9:30

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Orientação

CO-ORIENTADOR

Matthias Kittelmann

Novartis Pharma. Inst. of BioMedical Research

Doutor

ORIENTADOR

Ana Margarida Nunes da Mata Pires de Azevedo

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Equip.Prof.Auxiliar Convidado