Dissertação

Förster Resonance Energy Transfer to study periplasmic protein interaction in vivo, PBP5 a first candidate EVALUATED

O mecanismo de divisão celular das bactérias é levado a cabo por várias proteínas. Estas constituem potenciais novos alvos para antibióticos que venham ultrapassar o preocupante problema de aparecimento de bactérias resistentes a estas drogas. De modo a estudar o interatoma destes mecanismos, esta dissertação reporta o desenvolvimento de um setup experimental para estimar a eficiência de FRET no periplasma de Escherichia coli, utilizando proteínas de fusão fluorescentes. Descrevem-se os processos de construção de DNA recombinante e teste da funcionalidade, localização e estabilidade das proteínas de fusão. A fusão direta de sfGFP e mCherry, e as proteínas de fusão sfGFP-PBP5 e mCherry-PBP5 foram o objecto de estudo. Apresentam-se eficiências de FRET determinadas através de dois métodos diferentes, FRET espetral, combinado com spectral unmixing, e FLIM-FRET. Detetou-se, para a fusão direta das proteínas fluorescentes através do método de FRET espectral, uma eficiência de FRET, para o dador, de cerca de 18,5 % e, para o aceitador, de cerca de 8,4%. Através do método de FLIM-FRET foi detetada uma eficiência de FRET de 3,58% e 4,50% para a mesma proteína de fusão quando se testaram células fixas e vivas, respetivamente. A co-expressão de mCherry-PBP5 e sfGFP-PBP5 revelou um sinal de FRET significativo através da técnica de FLIM-FRET sem indução da expressão com células fixas e vivas – 4,01 e 3,03%, respetivamente. O controlo negativo da experiência resultou em eficiências de FRET nulas indicando robustez do sistema e fiabilidade dos resultados.
FRET, FLIM, periplasma, mCherry, sfGFP, PBP5

Outubro 30, 2012, 9:0

Documentos da dissertação ainda não disponíveis publicamente

Orientação

CO-ORIENTADOR

René Van der Ploeg

Universidade de Amesterdão

Doutor

ORIENTADOR

Arsénio do Carmo Sales Mendes Fialho

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Professor Associado