Dissertação

Expression of Thermobifida fusca cellulases in E.coli EVALUATED

A celulose é convertida em açúcares pela ação de celulases, enzimas capazes de hidrolisar ligações β-1,4-glicosídicas. Esses açúcares poderão ser posteriormente fermentados produzindo um combustível líquido, bioetanol. A crescente preocupação sobre a escassez de combustíveis fósseis e seus impactos ambientais fazem com que o estudo das celulases, a fim de encontrar alternativas renováveis, seja muito importante. O presente trabalho pretendeu expressar a endoglucanase Cel6A e exoglucanase Cel6B de Thermobifida fusca em Escherichia coli. Assim as suas regiões codificantes foram amplificadas por PCR a partir do gDNA de T. fusca e posteriormente clonadas em plasmídeos de expressão constitutiva com promotores de diferentes forças, pCXhP##, ou de expressão indutível, pIXhPtrc. Os produtos dos genes cel6A e cel6B seriam fundidos a uma cauda de histidinas em C-terminal, sendo que uma das variantes de CelB apresentaria ainda um local de hidrólise para uma enteroquinase. Tentaram-se construir os plasmídeos pCXhP34_Cel6A, pCXhP34_Cel6A-His, pCXhP34_Cel6B, pCXhP34_Cel6B-His, pCXhP14_Cel6B, pCXhP78_Cel6B, pIXhPtrc_Cel6B e pIXhPtrc_Cel6B_ECS-His, mas apenas se obtiveram os pCXhP34_Cel6A-His e pCXhP34_Cel6B-His. Os genes em questão foram completamente sequenciados e testou-se a sua expressão em E. coli (crescida em meios LB e mínimo). A concentração de proteína extracelular foi medida a 280 nm e calculada através dos coeficientes de extinção. Não foi possível expressar níveis detetáveis de qualquer das proteínas. Adicionalmente, quando testada a atividade do extrato extracelular supostamente contendo Cel6B-His sobre Avicel, verificou-se uma interferência do meio mínimo. Apesar dos resultados obtidos considera-se da maior importância a continuação do estudo das celulases dado o seu potencial impacto no mercado energético.
celulases, Escherichia coli, expressão extracelular, atividade, Thermobifida fusca

Novembro 13, 2012, 14:0

Documentos da dissertação ainda não disponíveis publicamente

Orientação

CO-ORIENTADOR

Tom Desmet

University of Gent

Professor

ORIENTADOR

Leonilde de Fátima Morais Moreira

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Professor Auxiliar