Dissertação

Production of recombinant human cytochrome P450 (1A1) in E. coli JM109: Fed-batch fermentation in 20 L scale with a novel phage resistant strain EVALUATED

De modo a obter uma estirpe melhorada de E. coli para a produção da proteína recombinante citocromo P450 1A1 (CYP1A1) (como biocatalisador para a síntese de metabolitos de medicamentos), foi estudado o efeito da co-expressão do citocromo b5 (cit. b5). A estirpe original, expressando as proteínas CYP1A1 e NADPH P450 reductase (P450 reductase), E. coli JM109 (1A1), demonstrou um valor de actividade 1.76 vezes superior ao da estirpe que co-expressa o citocromo b5, E. coli JM109 (1A1 b5). Uma fermentação fed-batch, com um volume útil de 20 L, fonte de carbono glicerol e mantendo o oxigénio dissolvido (OD) inferior a 5 %, foi efectuada com a estirpe E. coli JM109 (1A1), obtendo-se um valor máximo de actividade (medido em termos de conversão) de cerca de 24 %. Nas fermentações seguintes ocorreram contaminações de bacteriófagos com concentrações entre 5.6 × 10^9 plaque forming units (PFU)/mL e 7.6 × 10^10 PFU/mL. O problema da contaminação foi ultrapassado através da selecção de uma estirpe de E. coli JM109 (1A1) resistente a bacteriófagos e o protocolo da fermentação fed-batch aplicado à estirpe não resistente foi implementado a essa nova estirpe, E. coli JM109 (1A1) phage resistant (PR) 1A. Em frascos de cultura provou-se que a estirpe resistente possuía actividade da proteína CYP1A1 tão elevada quanto a da não resistente. Esta estirpe apenas apresentou actividade em fermentação fed-batch aquando o controlo da taxa de crescimento entre 0.5-0.8 OD600/h e mantendo o valor de OD próximo de 0 %, tal como para a estirpe não resistente.
Citocromo P450 1A1 (CYP1A1), E. coli JM109, fermentação fed-batch, oxigénio dissolvido (OD), contaminação por bacteriófagos

Setembro 30, 2011, 11:0

Documentos da dissertação ainda não disponíveis publicamente

Orientação

CO-ORIENTADOR

Matthias Kittelmann

Novartis Pharma. Inst. of BioMedical Research

ORIENTADOR

Duarte Miguel De França Teixeira dos Prazeres

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Professor Associado