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Dissertação

Plasmid DNA Recovery and Purification by Tangential Flow Filtration EVALUATED

Detalhes: Neste trabalho, após a produção de DNA plasmídico ? pVAX1/lacZ ? 6050 pb por fermentação de E. coli DH5alfa; esta biomolécula foi libertada por lise celular, utilizando um método de ruptura mecânica ? sonicação. Como este método apresenta elevadas tensões de corte foi efectuado na presença de agentes compactantes (CaCl2), minimizando a degradação mecânica através da sua precipitação. Para obter o plasmídeo predominantemente na sua forma superenrolada e eliminar grande parte das impurezas existentes (gDNA, RNA, proteínas, endotoxinas, etc.) os lisados obtidos na ruptura mecânica foram sujeitos a filtração tangencial utilizando um módulo de fibras ocas. Numa primeira fase estudou-se a separação do pDNA precipitado dos restantes componentes solúveis usando lisados não clarificados e diafiltração descontínua. Numa segunda fase estudou-se a separação do pDNA precipitado dos restantes componentes solúveis usando lisados clarificados e concentração descontínua. Em ambas as fases estudou-se a influência do tamanho de poro (500 kDa, 750 kDa, 0.1 µm, 0.2 µm e 0.45 µm) das membranas utilizadas na separação e grau de pureza do plasmídeo. No que diz respeito às membranas de menor poro não isolaram significativamente o plasmídeo das impurezas tanto na primeira fase deste trabalho como na segunda; no que refere às membranas de maior poro (0.2 e 0.45 µm) conseguiu-se isolar o plasmídeo das impurezas com uma retenção de 91 e 90%, respectivamente, com purezas de HPLC correspondentes de 32% e 46%, na primeira fase; na segunda foi possível uma retenção de plasmídeo de 66 e 84% com purezas de 52 e 44%, respectivamente.
Keywords: vacinas de DNA plasmídico, filtração tangencial, módulo de fibras ocas, purificação

Discussão: dezembro 7, 2010, 15:0

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