Transfection of HEK293T cells with constitutive and inducible plasmid DNA vectors using a novel microporation technology EVALUATED

Detalhes: Neste trabalho foram comparados vectores de expressão de genes indutíveis e constitutivos, usando plasmídeos com replicação episomal em células HEK293T e genes reporter que codificam para as duas proteínas fluorescentes GFP e YFP.Os plasmídeos foram introduzidos nas células por electroporação utilizando um equipamento desenvolvido recentemente. Nos diferentes sistemas de expressão foi avaliada a eficiência de transfecção, a viabilidade celular, a recuperação final das células e o rendimento de transfecção. Comparou-se também a citotoxicidade das duas proteínas fluorescentes. A optimização das condições de electroporação foi realizada utilizando um desenho experimental no qual se variou a voltagem,o tempo de pulso,o número de pulsos e a quantidade de DNA.Verificou-se que os parâmetros que têm mais influência na eficiência de transfecção são a voltagem e a quantidade de DNA,tendo sido obtido melhores resultados com 1200V e 3ug de DNA. Verificou-se neste trabalho que a tranfecção de células HEK293T com vectores de expressão constitutiva é mais eficiente tendo sido obtido um rendimento de transfecção de 50%,em que 30-40% das células transfectadas eram GFP positivas. Após a electroporação a grande maioria das células foi recuperada e obtiveram-se excelentes valores de viabilidade celular (90-95%). Após adição de antibiótico de selecção, foram isoladas várias colónias em que 100% das células expressavam as proteínas fluorescentes. Com este trabalho,é sugerida uma metodologia que poderá ser utilizada para transfectar e seleccionar células HEK293T que expressam uma proteína de interesse a partir de um plasmídeo com replicação episomal. As colónias selecionadas poderão ser posteriormente expandidas para produzir proteínas recombinadas em larga escala.

Discussão: junho 2, 2009, 10:0

Orientação

AUTOR

Meritxell Zurita Turk (ist164560)

CO-ORIENTADOR

Teresa Catarina Páscoa Madeira

Centro de Engenharia  Biológica e Química , IST

Especialista

ORIENTADOR

Joaquim Manuel Sampaio Cabral

Departamento de Engenharia Química e Biológica (DEQB)

Professor Catedrático