Dissertação

Transfection of HEK293T cells with constitutive and inducible plasmid DNA vectors using a novel microporation technology EVALUATED

Neste trabalho foram comparados vectores de expressão de genes indutíveis e constitutivos, usando plasmídeos com replicação episomal em células HEK293T e genes reporter que codificam para as duas proteínas fluorescentes GFP e YFP.Os plasmídeos foram introduzidos nas células por electroporação utilizando um equipamento desenvolvido recentemente. Nos diferentes sistemas de expressão foi avaliada a eficiência de transfecção, a viabilidade celular, a recuperação final das células e o rendimento de transfecção. Comparou-se também a citotoxicidade das duas proteínas fluorescentes. A optimização das condições de electroporação foi realizada utilizando um desenho experimental no qual se variou a voltagem,o tempo de pulso,o número de pulsos e a quantidade de DNA.Verificou-se que os parâmetros que têm mais influência na eficiência de transfecção são a voltagem e a quantidade de DNA,tendo sido obtido melhores resultados com 1200V e 3ug de DNA. Verificou-se neste trabalho que a tranfecção de células HEK293T com vectores de expressão constitutiva é mais eficiente tendo sido obtido um rendimento de transfecção de 50%,em que 30-40% das células transfectadas eram GFP positivas. Após a electroporação a grande maioria das células foi recuperada e obtiveram-se excelentes valores de viabilidade celular (90-95%). Após adição de antibiótico de selecção, foram isoladas várias colónias em que 100% das células expressavam as proteínas fluorescentes. Com este trabalho,é sugerida uma metodologia que poderá ser utilizada para transfectar e seleccionar células HEK293T que expressam uma proteína de interesse a partir de um plasmídeo com replicação episomal. As colónias selecionadas poderão ser posteriormente expandidas para produzir proteínas recombinadas em larga escala.
Células HEK293T, Proteínas reporter, Vectores de expressão de genes, Electroporação, Produção de proteínas recombinadas

Junho 2, 2009, 10:0

Documentos da dissertação ainda não disponíveis publicamente

Orientação

CO-ORIENTADOR

Teresa Catarina Páscoa Madeira

Centro de Engenharia  Biológica e Química , IST

Especialista

ORIENTADOR

Joaquim Manuel Sampaio Cabral

Departamento de Engenharia Química e Biológica (DEQB)

Professor Catedrático