Directed Evolution of Pentose Isomerases for the Production of Rare Sugars EVALUATED

Detalhes: Actualmente, a produção de L-ribose é assegurada quer por processos químicos quer por processos enzimáticos, sendo que os métodos desenvolvidos apresentam vários problemas. Uma das soluções mais engenhosas consiste no uso de um açúcar de baixo custo, D-ribose produzindo o intermediário L-ribulose. A enzima L-ribose isomerase que catalisa a reacção reversível entre L-ribulose e L-ribose encontra-se patenteada para a produção de L-ribose. Usando uma estratégia de evolução direccionada é possível criar variantes da enzima D-mannose isomerase (E.C.5.3.1.7) em variantes capazes de converter outros substratos, nomeadamente L-ribose. D-mannose isomerase é uma enzima que catalisa a isomerisação reversível entre D-mannose (aldeído) e D-fructose (cetona), codificada pelo gene YihS em Escherichia coli. A evolução direccionada consiste num processo iterativo que simula a selecção natural promovendo o aperfeiçoamento de características já presentes na enzima. Cada ronda de evolução direccionada baseia-se num passo inicial de mutação aleatória de um gene, resultando numa bibiolteca de mutantes posteriormente escolhidos por selecção, usando um hospedeiro e um meio de crescimento apropriados, ou por screening, medindo a actividade enzimática de cada um dos mutantes. O gene YihS foi clonado e expresso numa estirpe especificamente desenhada para o efeito. Os parâmetros que maximizavam a actividade da enzima D-mannose isomerase foram determinados e usados como ponto de partida para a análise de actividade dos variantes enzimaticos. De seguida por mutação aleatória foi criada uma biblioteca de mutantes. Porém não se encontraram variantes enzimáticos que demonstrassem actividade na isomerisação de L-ribose. Uma nova metodologia de screening para ceto-açúcares foi desenvolvida e optimizada.

Discussão: dezembro 9, 2009, 10:0

Orientação

AUTOR

João Filipe da Conceição Gavinho e Silva (ist151846)

CO-ORIENTADOR

Wim Soetaert

Faculty of Bioscience Engineering, Ghent University

Especialista

ORIENTADOR

Isabel Maria De Sá Correia Leite de Almeida

Departamento de Engenharia Química e Biológica (DEQB)

Professor Catedrático