Dissertação

Towards the characterisation of the cap-snatching endonuclease domain within Bunyamwera virus L protein EVALUATED

A família Bunyaviridae é uma das maiores famílias de vírus existente, sendo o vírus Bunyamwera a espécie tipo. Estes vírus são caracterizados por possuírem um genoma de RNA tripartido com polaridade negativa, sendo que o segmento L codifica para a polimerase viral (proteína L). O seu ciclo infeccioso é iniciado pela transcrição primária, que é um mecanismo dependente de primers. O domínio endonuclease da proteína L é de extrema importância, permitindo clivar as estruturas ?cap? das extremidades 5? do mRNA do hospedeiro para tal efeito. O mRNA viral é sintetizado, possuindo 10-20 nucleótidos ?non-template? na extremidade 5?. Baseado em recentes estudos estruturais do domínio endonuclease em Influenza, o presente estudo descreve a utilização de diversas ferramentas de proteómica para a caracterização do referido domínio na proteína L do vírus Bunyamwera. Doze fragmentos foram desenhados em torno do motivo de nuclease PD-(D/E)XK, encontrado na extremidade N de L, sendo expressos em E.coli sob controlo do promotor T7. Diversas condições de expressão e purificação foram testadas, onde a observação de fenómenos de instabilidade proteica levou ao abandono do estudo da fase solúvel. Apenas um dos fragmentos, BUNL6, foi seleccionado para estudos posteriores. A recuperação e purificação a partir de corpos de inclusão permitiram a obtenção de quantidades consideráveis de proteína (~3.3 mg por 1.5 L de cultura), possibilitando efectuar ensaios de ?refolding? e actividade. Estes últimos revelaram-se no entanto inconclusivos. Alternativamente, estudos de optimização da solubilidade ou de mutação em prováveis resíduos-chave para a actividade catalítica poderão contornar os obstáculos encontrados.
Vírus Bunyamwera, proteína L, RNA polimerase dependente de RNA, mecanismo de ?cap-snatching?, domínio e actividade de endonuclease.

Dezembro 4, 2009, 16:0

Documentos da dissertação ainda não disponíveis publicamente

Orientação

CO-ORIENTADOR

Richard M Elliott

University of St. Andrews

Especialista

ORIENTADOR

Arsénio do Carmo Sales Mendes Fialho

Departamento de Engenharia Química e Biológica (DEQB)

Professor Associado