Dissertação

Production of a thermostable sucrose phosphorylase EVALUATED

A celobiose é um açúcar redutor com elevados custos de produção que, por esta razão, tem poucas aplicações. Recentemente, um processo alternativo e mais barato para a sua obtenção foi sugerido: este utiliza sacarose como matéria-prima e recorre à acção combinada de três enzimas diferentes. O primeiro passo deste novo processo, no qual se insere esta tese, usa a enzima sacarose fosforilase para produzir glucose-1-fosfato e frutose a partir de sacarose. O principal objectivo deste projecto foi a criação de uma sacarose fosforilase termofílica, para uso num novo processo industrial de produção de celobiose, tendo por base a proteína obtida de Leuconostoc mesenteroides. Para tal, recorreu-se a uma técnica de evolução dirigida, também conhecida por mutagénese de saturação. O gene da sacarose fosforilase foi clonado num vector de expressão sob o controlo de um promotor lac; a sua expressão foi feita em células de E. coli XL 10-Gold o que obrigou à optimização das condições de crescimento e indução dos microorganismos. A caracterização das regiões a alterar foi feita primeiro numa das estruturas cristalinas da proteína disponíveis, de Bifidobacterium adolescentis, tendo sido depois identificadas na sequência correspondente de Leuconostoc mesenteroides. Primers contendo uma sequência mismatch aleatória de nucleótidos (NNK) foram criados e utilizados em experiências de mutagénese de saturação: os resultados deram conta de uma baixa eficiência de mutação apesar dos vários esforços levados a cabo para os melhorar, fazendo variar a temperatura de annealing. No final desta investigação, ainda não tinham sido identificadas quaisquer putativas enzimas termofílicas.
sacarose fosforilase; evolução dirigida; mutagénese de saturação; termoestabilidade

Outubro 31, 2008, 11:30

Documentos da dissertação ainda não disponíveis publicamente

Orientação

CO-ORIENTADOR

Erick Vandamme

LIMAB, Universidade de Gent

Especialista

ORIENTADOR

Isabel Maria De Sá Correia Leite de Almeida

Departamento de Engenharia Química e Biológica (DEQB)

Professor Catedrático