FenixEdu™

Dissertação

Instabilidade genética em DNA plasmídico contendo repetições directas EVALUATED

Detalhes: A instabilidade estrutural é um dos traços mais significativos a ter em conta quando um plasmídeo se destina a ser utilizado em terapia genética. A instabilidade estrutural dos plasmídeos pode ser diminuída utilizando estirpes recA e evitando a presença de regiões de instabilidade em plasmídeos, correntemente conhecidas por hotspots. São frequentes os eventos de recombinação RecA-independentes devido à presença de repetições directas ou inversas. Resultados recentes não publicados têm demonstrado que estes fenómenos de recombinação ocorrem no candidato a vacina de DNA contra a raiva pGPV-PV bem como no plasmídeo comercial que lhe deu origem, pCIneo. Ambos contêm duas repetições directas de 28 pares de bases, as quais são responsáveis pela existência de recombinação RecA-independente e pela aquisição de um fenótipo com resistência à canamicina. Este trabalho envolveu a clonagem do gene da GFP no plasmídeo pCIneo, imediatamente a jusante do gene da neomicina-fosfotransferase. O intuito foi permitir a monitorização da expressão deste gene por citometria de fluxo em células de Escherichia coli DH5na presença e ausência de stress por canamicina. Concluiu-se, contrariamente ao que se esperava, que as alterações realizadas no plasmídeo pCIneo, influenciaram de forma negativa a capacidade de recombinação RecA-independente deste plasmídeo. Foi adicionalmente realizado um estudo da influência da intensidade de stress e do tempo de exposição no espectro de produtos de recombinação RecA-independente do plasmídeo pGPV-PV. Os resultados obtidos apontaram para que, para além de características estruturais e genotípicas, o leque de produtos de recombinação obtidos é também bastante dependente destes factores.
Keywords: Escherichia coli; plasmídeo; sequências de repetição directa; stress, canamicina; recombinação.

Discussão: outubro 19, 2007, 14:30

Documentos da dissertação ainda não disponíveis publicamente