Dissertação
Design of a Scalable Strategy for the Initial Recovery and Capture of Bacteriophages: Nuclease Digestion and Phenyl Boronate Chromatography EVALUATED
As bactérias resistentes a antibióticos são uma preocupação para a saúde, dado não possuírem tratamentos eficazes. Os bacteriófagos poderão ser uma solução para este problema. Estes são vírus que infectam bactérias, impedindo a sua replicação e diminuindo a concentração pela indução à lise celular. Terapias com base de fagos requerem uma suspensão altamente purificada, o que não é alcançado pela infeção natural. A purificação atualmente utilizada, precipitação com polietilenoglicol seguida por ultracentrifugação em gradiente de CsCl, é inadequada para a purificação de grandes quantidades de fagos. Esta dissertação teve como objetivo remover proteínas e DNA bacterianos (E. coli) de uma suspensão de fagos T4 sem diminuição da infectividade. As técnicas estudadas foram a digestão com DenaraseⓇ e a Cromatografia de Fenil Boronato. Na digestão foram testados quatro tempos de incubação (30 minutos, 1 hora, 1 hora e 30 minutos e 2 horas), paragens de atividade enzimática (72 oC e gelo) e comportamento na presença/ausência do cofator enzimático. A digestão ao lisado apresenta os melhores resultados, com rendimento (69,33%) e remoção de DNA bacteriano (99,96%), para os 30 minutos de incubação, sendo a remoção de proteínas bacterianas, 95,91%, superior para 1 hora e 30 minutos de incubação. Diferentes condições de adsorção e eluição foram testadas na cromatografia, sendo os melhores resultados (49,49% de rendimento, 96,61% e 47,60% remoção de proteína e DNA, respectivamente) obtidos usando 15 mM Tris-HCl, pH 7 como adsorção, e 1,5 M Tris-HCl, pH 8,5 como eluição.
outubro 14, 2021, 10:0
Publicação
Obra sujeita a Direitos de Autor
Orientação
ORIENTADOR
Ana Margarida Nunes da Mata Pires de Azevedo
Departamento de Bioengenharia (DBE)
Professor Auxiliar