Dissertação

Separation of CHO-derived vesicles through multimodal and heparin affinity chromatography EVALUATED

As células CHO são amplamente usadas para a produção de anticorpos monoclonais. No entanto, durante a sua cultura celular, são também libertadas vesículas extracelulares. É necessário estudar estas vesículas para garantir a qualidade do biofármaco produzido e para caracterização. As vesículas extracelulares são uma população heterogénea que inclui exosomas e microvesículas, envolvidos na comunicação intercelular. Sabe-se que o seu conteúdo proteico, lipídico e genético tem implicações na tumorigénese e infecção, mas constituem impurezas no processo de cultura, onde o seu papel é ainda incerto. Numa linha CHO-S produtora de trastuzumab, foram detectadas 2.2x10^11 partículas/mL com diâmetro entre 30 e 300 nm após centrifugação do caldo. De modo a separar diferentes tipos de vesículas extracelulares do sobrenadante clarificado e filtrado, foi aplicado um processo cromatográfico de dois passos. O primeiro consistiu numa cromatografia multimodal em modo negativo que assegurou uma recuperação de 49.3% das partículas e captura de impurezas. Para diferenciar vesículas, foi depois aplicada uma cromatografia de afinidade com heparina onde se recuperaram 45.8% das partículas. Duas populações com diferentes perfis proteicos foram separadas (74.1% na fracção não retida e 25.9% na eluição), mas os marcadores exosomais típicos não permitiram classificar as vesículas de acordo com as denominações estabelecidas. Este método cromatográfico provou ser útil na compreensão das vesículas extracelulares e constitui uma alternativa a técnicas de separação actuais. A identificação de diferentes proteínas nas duas populações confirma a complexidade destas vesículas, provando-se que a sua heterogeneidade e quantidade dependem do tipo de células, tempo de colheita e stress aplicado.
vesículas extracelulares, exosomas, microvesículas, cromatografia, Capto™ Core 700, Capto™ Heparin

Novembro 23, 2018, 14:0

Documentos da dissertação ainda não disponíveis publicamente

Orientação

ORIENTADOR

Alois Jungbauer

University of Natural Resources and Life Sciences (BOKU)

Professor

ORIENTADOR

Ana Margarida Nunes da Mata Pires de Azevedo

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Professor Auxiliar