Dissertação
Imaging synthesized phosphatidylserine incorporation in single liposomes EVALUATED
Reconstituir a síntese de lípidos no interior de vesículas lípidicas é fundamental para atingir o crescimento e divisão de uma célula artificial com os componentes mínimos para ser considerada viva, numa abordagem bottom-up. A deteção da síntese de lípidos dentro de lipossomas foi realizada por métodos que analisam a população total de vesículas. No entanto, a incorporação de lípidos síntetizados na membrana de vesículas individuais ainda não foi demonstrada. Nesta abordagem, os genes da via metabólica Kennedy e o sistema transcrição-tradução in vitro PURE foram encapsulados. Os lipossomas foram incubados no exterior com a proteína eGFP-lactC2, que demonstrou especificidade para a fosfatidilserina (PS). Utilizando microscopia confocal de fluorescência, a colocalização do sinal de eGFP com a membrana da maioria dos lipossomas foi observada. Adicionalmente, demonstrou-se que 55% das vesículas estão enriquecidas em PS. Através do seguimento temporal dos lipossomas enriquecidos, uma estimativa da cinética de incorporação de fosfolípidos foi obtida, no sistema desenvolvido: entre 3.1 a 5.7 horas. A quantificação dos níveis de fosfolípidos incorporados não foi possível, dado que a caracterização do método revelou uma relação não linear entre a intensidade de fluorescência na membrana e a concentração de PS. O presente trabalho comprova a incorporação de fosfolípidos sintetizados dentro de lipossomas na sua membrana. Estes resultados são considerados pioneiros, possibilitando estudos futuros com respeito ao crescimento e divisão de uma célula artificial.
outubro 3, 2018, 9:30
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