Dissertação

Cloning and overexpression of the CaiC protein from the caiTABCDE operon involved in the biosynthesis of L-carnitine in Escherichia coli EVALUATED

A procura por L-carnitina tem estado atualmente a aumentar, principalmente em medicina. Desta forma, estudos focados na melhoria e otimização da sua produção biotecnológica são de interesse crescente. O objetivo deste trabalho foi entender melhor e estudar o papel do gene caiC do operão caiTABCDE de Escherichia coli, e a respetiva proteína codificada, para obter informação que possa ajudar no aperfeiçoamento da bioprodução de L-carnitina. Transformações de caiC, usando plasmídeo pRSET como vetor, foram efetuadas com êxito em E. coli K-12 Top10F’ para a propagação do plasmídeo. A sobreexpressão de proteínas foi efetuada na estirpe E. coli BL21. Diferentes condições de purificação foram testadas para otimizar a quantidade e preservar a atividade nativa da proteína CaiC, sendo que a última obteve uma concentração de 10.54 M e uma atividade específica máxima de 0.388 U/mg. Com eletroforese de gel nativo de poliacrilamida e estudos por cromatografia de permeação em gel foi verificado que a conformação nativa de CaiC era provavelmente um tetrâmero, com um peso molecular de aproximadamente 250 kDa. Testes de atividade com quatro substratos diferentes conhecidos, nomeadamente, crotonobetaina, γ-butyrobetaina, D- e L-carnitina, foram realizadas e verificou-se que CaiC seguia uma cinética de Michaelis-Menten, onde valores de Km de 0,500, 0,485, 3,567 e 0,250 mM, respetivamente, foram estimados. Desta forma, CaiC apresenta possuir uma maior afinidade com L-carnitina. CaiC não estava inicialmente acetilada e apenas acetil-CoA apresentou capacidade de a acetilar. A acetilação aparentemente afeta a atividade ao diminuir a afinidade de CaiC.
Via da L-carnitina em Escherichia coli, operão caiTABCDE, caiC, L-carnitina, Clonagem e sobreexpressão de proteínas

Novembro 29, 2016, 11:0

Publicação

Obra sujeita a Direitos de Autor

Orientação

ORIENTADOR

Manuel Cánovas Díaz

Universidad de Murcia

Professor

ORIENTADOR

Gabriel António Amaro Monteiro

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Professor Associado