Dissertação

Developing quantitative mass spectrometry workflows for global identification and characterization of proteins EVALUATED

Marcação com isótopos estáveis por dimetilação é uma técnica quantitativa de espectrometria de massa que permite quantificação relativa de proteínas e de péptidos, com base na incorporação de marcadores isotopoméricos. Para além de ser uma técnica simples e robusta, é económica e pode ser aplicada em todos os tipos de amostras biológicas. O objectivo deste projecto foi fazer o scale down de um protocolo de marcação on-column para um StageTip, recorrendo a isotopómeros de formaldeído e de cianoborohidreto de forma a incorporar um grupo dimetil leve e intermédio. Primeiramente, esta técnica foi aplicada numa proteína modelo usando o MALDI-TOF, onde uma comparação entre a técnica in-solution e StageTip foi realizada. Verificou-se que o protocolo com StageTip era mais eficaz, porque mais dupletos de péptidos foram identificados. Seguidamente, procedeu-se a uma análise num sistema LC-MS/MS, onde mais péptidos foram identificados e quantificados. Depois de se estabelecer um protocolo eficiente, uma análise proteómica bottom-up foi realizada numa amostra de S. aureus cultivada na presença ou ausência de sobrenadante de S. epidermidis. Foi possível identificar 993 proteínas, das quais 650 foram quantificadas viavelmente. Destas proteínas, 41 revelaram-se sobre-expressas, enquanto 111 sub-expressas. Em suma, foi possível estabelecer um protocolo para marcar por dimetilação num StageTip, assim como se demonstrou que o método é viável para identificação e quantificação de proteínas.
Espectrometria de massa, Proteómica quantitativa, Dimetilação, MALDI, Orbitrap Fusion

Setembro 23, 2016, 10:0

Publicação

Obra sujeita a Direitos de Autor

Orientação

ORIENTADOR

Per Mårten Hägglund

Technical University of Denmark

Associate Professor

ORIENTADOR

Miguel Nobre Parreira Cacho Teixeira

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Professor Auxiliar