Dissertação
Knockdown of Monocyte Chemotactic Protein 1 in human mesenchymal stromal cells using two different approaches: shRNA and CRISPR Cas 9 EVALUATED
De forma a estudar a interacção entre células humanas HSPC, MSCs e monócitos/macrófagos em modelos murinos, o objectivo deste projecto foi a criação de MSCs humanas que não secretam CCL2, usando tanto a abordagem do shRNA, como a abordagem do CRISPR-Cas 9 . Para o efeito, três shRNAs e cinco sgRNAs foram clonados nos vectores de expressão FUW-Luciferase Cherry e PX458, respectivamente. Os vectores recombinantes de shRNA foram usados para criar partículas lentivirais para a transdução das MSCs. As MSCs transduzidas foram então analisadas por Q-PCR, a fim de avaliar a eficiência do knockdown do gene do CCL2. No que respeita à abordagem do CRISPR-Cas, foram feitas combinações de dois gRNAs, de forma fazer cortes duplos no gene do CCL2. Os vectores recombinantes foram então transfectados para células HEK 293T e os danos do ADN foram avaliados por Phusion Hot Start Flex PCR, seguido por um gel de electroforese. Embora o ADN viral tenha sido integrado no genoma das células transduzidas, não houve contudo uma regulação negativa na produção de CCL2. Relativamente à abordagem do CRISPR-Cas 9, os cortes de ADN esperados foram observados com sucesso no gel de electroforese. Em conclusão, a abordagem CRISPR-Cas 9 provou ser um sucesso a danificar o gene do CCL2. Por outro lado, a abordagem de shRNA precisará de algumas alterações, de modo a alcançar também com sucesso a regulação negativa de CCL2 em MSCs.
novembro 20, 2015, 9:30
Publicação
Obra sujeita a Direitos de Autor
Orientação
ORIENTADOR
Arsénio do Carmo Sales Mendes Fialho
Departamento de Bioengenharia (DBE)
Professor Associado