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Dissertação

Screening and evaluation of synthetic protein-mimic affinity ligands for the purification of plasmid DNA EVALUATED

Detalhes: As vacinas de DNA e a terapia genética são, hoje em dia um tópico importante da investigação em Medicina, sendo a purificação de plasmídeos particularmente relevante para a produção de vacinas. A cromatografia de afinidade é uma das técnicas mais usadas na purificação de plasmídeos. Vários tipos de ligandos de afinidade são usados, nomeadamente ligandos biológicos e ligandos sintéticos. Neste estudo foi feito o rastreio aleatório de uma biblioteca de ligandos sintéticos, previamente sintetizada para purificar imunoglobulinas, para ligar DNA. Foi usado um método de alto rendimento, baseado em homo-oligonucleotidos marcados com FITC, para fazer o rastreio de 169 ligandos na biblioteca de ligandos em condições hidrofilicas e hidrofóbicas. Apesar da formação de estruturas secundárias em cadeias de guanine, foram seleccionados com base neste método 22 ligandos que ligavam fortemente moléculas de DNA. A capacidade destes ligndos reconhecerem e ligarem sequencias de DNA de dupla cadeia foi avaliada usando homo-oligonucleotidos hibridizados (AT e GC). A partir destes estudos, os ligandos 1/2, 2/3, 6/7 e 7/6 foram seleccionados para estudos de ligação com plasmídeos purificados, seguidos de estudos de cromatografia de afinidade com extractos impuros de E. coli. Com os ligandos 1/2 e 6/7 conseguiu-se a purificação de DNA plasmídico usando 0,4M de sulfato de amónio em 20mM Tris-HCl pH=8 como tampão de equilíbrio em ambos os ligandos, num processo que excluiu DNA plasmidico nas primeiras fracções. O melhor resultado foi obtido com o ligando 6/7, onde se obteve um rendimento de 64% e uma pureza de 82%.
Keywords: ligandos sintéticos, biomimético, biblioteca combinatorial de ligandos, rastreio de alto rendimento, cromatografia de afinidade, purificação de plasmídeos

Discussão: novembro 25, 2013, 11:0

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