Dissertação

Minimizing the influence of fluorescent tags on the partition of IgG in PEG-salt aqueous two-phase systems towards miniaturized rapid screening applications EVALUATED

A extracção por duas fases aquosas oferece um vasto potencial para a separação de produtos biofarmacêuticos, como os anticorpos monoclonais. No entanto, o comportamento da molécula alvo em cada condição é difícil de prever, o que torna as ferramentas de rastreio de alto rendimento valiosas para a realização desta optimização. Recentemente, dispositivos microfluídicos recorrendo à microscopia de fluorescência têm sido explorados de forma a continuamente monitorizar a partição do IgG. Estes dispositivos proporcionam curtas distâncias de difusão e uma rápida partição molecular, utilizando volumes mínimos de reagentes. Contudo, a influência da marcação com fluoróforos na partição de IgG deve ser estudada antes de extrapolar os resultados obtidos para a molécula não-marcada, um efeito crítico mas inexplorado. Neste trabalho experimental, três fluoróforos com diferentes cargas e reactividade, o BODIPY™ FL maleimide, o Alexa Fluor® 430 e o BODIPY™ FL NHS Ester, foram seleccionados para a marcação do IgG, obtendo vários graus de marcação para cada. De modo a caracterizar cada conjugado, diversas técnicas foram realizadas: extracção por duas fases aquosas utilizando microtubos ou microcanais, electroforese SDS-PAGE e focagem isoeléctrica. A marcação com o BODIPY™ FL maleimide com o uso do tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), gerando grupos tiol livres sem comprometer a estrutura terciária, foi a estratégia mais promissora encontrada. Com este fluoróforo, o coeficiente de partição obtido num sistema PEG3350-fosfato, com e sem adição de NaCl, foi semelhante entre os microtubos e os microcanais, e também análogo com os valores alcançados para a molécula não-marcada, quantificados por cromatografia analítica da proteína G.
anticorpos monoclonais, ATPE, downstream processing, dispositivos microfluídicos, fluoróforos

outubro 30, 2018, 11:0

Publicação

Obra sujeita a Direitos de Autor

Orientação

ORIENTADOR

Rúben Rafael Gonçalves Soares

INESC & iBB - Instituto Superior Técnico

Doutor

ORIENTADOR

Maria Raquel Murias dos Santos Aires Barros

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Professor Catedrático