Dissertação
Evaluation of a Genome Editing Approach in Lactic Acid Bacteria Based on the CRISPR/Cas9 System EVALUATED
A vacinação de DNA plasmídico (pDNA) promete o tratamento de doenças autoimunes, infeciosas e genéticas. Atualmente, E. coli é o hospedeiro predileto para a produção de plasmídeo. No entanto, a maioria dos métodos de extração de pDNA co-purificam lipopolissacáridos (LPS) presentes na parede celular, desencadeando respostas inflamatórias em hospedeiros. As bactérias ácido lácticas (BAL) são organismos GRAS e não possuem LPS, sendo usadas em nutrição e saúde humana há muitos anos. É então proposta a utilização das BAL como fábricas celulares para a produção de pDNA. Obstáculos associados ao uso das BAL para este fim incluem a falta de plasmídeos e características que o permitem. O presente trabalho tem por objetivo modificar geneticamente Lactococcus lactis LMG 19460, usando o sistema CRISPR/Cas9, de forma a diminuir as condições severas para a produção de pDNA. Aplicações desta estirpe melhorada incluem a produção industrial de pDNA e entrega de DNA no contexto da terapia génica. O plasmídeo nthCRISPRa, modificado a partir do pKCcas9dO, foi, sem sucesso, transformado por electroporação em L. lactis LMG 19460 de forma a incitar a deleção do gene nth. Uma reação de PCR usando 250000 células foi desenvolvida para avaliar tanto a ocorrência de edição genómica, como a presença do nthCRISPRa. A reconstrução do nthCRISPRa em nthCRISPRe foi tentada por Gibson assembly de forma a alterar a marca de seleção apmR para eryR. Predições teóricas foram feitas para futuros knockouts. Ademais, o software OptFlux foi usado para prever knockouts não óbvios para o aumento da produção de DNA.
dezembro 14, 2017, 9:0
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