Dissertação

Overproduction and purification of Haa1 protein envisaging functional and structural studies of this transcription factor involved in yeast adaptive response to acetic acid EVALUATED

O fator de transcrição Haa1 é o regulador principal da resposta genómica da levedura a stress por ácido acético, regulando, de forma direta ou indireta, 80% dos genes, cuja transcrição é ativada em resposta a este ácido. Num trabalho anterior, com base na introdução de erros por PCR, foi gerado e selecionado um mutante Haa1-S135F (por substituição de uma serina por uma fenilalanina na posição 135) que apresenta uma maior tolerância a ácido acético. Esta mutação leva ao aumento da ativação da transcrição dos genes-alvo do Haa1, possivelmente devido a alterações na estrutura proteica a qual resulta na alteração da força de ligação com os locais de ligação nos promotores dos genes-alvo. Neste trabalho, tentou-se superproduzir extracelularmente a proteína Haa1, usando o sistema de expressão em Pichia pastoris. Dado que esta estratégia não foi bem sucedida, o sistema de expressão E.coli-pET foi usado para superproduzir as proteínas Haa1 e Haa1S135F—fundidas a uma cauda de histidinas, seguido de purificação usando cromatografia de afinidade com iões metálicos imobilizados e um polimento posterior, usando FPLC. De modo a analisar os complexos formados entre as proteínas Haa1 e a região promotora de um dos genes-alvo (TPO3) foi usada Microscopia de Força Atómica. Foi possível observar as ligações das proteínas Haa1 e Haa1S135F numa posição cerca de 1/3 da região promotora do gene TPO3, onde foi mapeado o local de ligação do Haa1. Resultados preliminares parecem sugerir que existam diferenças no perfil de alturas das proteínas Haa1 e Haa1S135F resultante da ligação ao DNA.
Factor de transcrição, Haa1, Saccharomyces cerevisiae, Resposta a ácido acético, Expressão de proteína recombinante, Microscopia de Força Atómica

novembro 18, 2016, 14:0

Publicação

Obra sujeita a Direitos de Autor

Orientação

ORIENTADOR

Isabel Maria De Sá Correia Leite de Almeida

Departamento de Bioengenharia (DBE)

Professor Catedrático