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Dissertação

Purification of antibody fragments by phenylboronate chromatography using a microfluidic device EVALUATED

Detalhes: Os anticorpos são glicoproteínas que possuem um elevado grau de afinidade e especificidade para os antigénios, e por isso, são aplicados em diversas áreas. No entanto quando utilizados como terapêuticos, apresentam algumas limitações, pelo que têm sido desenvolvidas alternativas para anticorpos completos, com destaque para os fragmentos de ligação do antigénio (Fabs). No entanto, a ausência de um universal ligando de afinidade requer o desenvolvimento de novos métodos para a sua purificação. Neste trabalho, o protocolo de digestão de anticorpos humanos foi inicialmente otimizado, levando ao aumento de 41% no rendimento do processo. Depois disso, a possibilidade de usar o ligando aminofenilboronato para a purificação das classes kappa e lambda de Fabs foi estudada, utilizando um dispositivo de microfluídica para o rastreio de diferentes condições cromatográficas, seguido da validação destes resultados à macro-escala. Realizou-se, ainda, o estudo da afinidade de várias impurezas, envolvidas na produção de fragmentos, para o ligando. Genericamente, abaixo do pKa do ligando, as ligações de afinidade, potenciadas por interações de transferência de carga, foram o fator dominante no processo de adsorção. Acima desse valor, repulsão electroestática suprimiu as interações de afinidade. Ligação maximizada dos Fabs para o fenilboronato foi verificada sob concentrações de sal intermédias e mais baixas a pH 5 e 7, respetivamente. Provavelmente associado a diferentes isotipos, os Fabs dividiram-se entre as frações que não ligaram à coluna e eluição, pelo que terão de ser realizar mais estudos para confirmar a possibilidade de utilização deste ligando para a sua purificação.
Keywords: aminofenilboronato, fragmento de ligação do antigénio, cromatografia, microfluídica

Discussão: novembro 25, 2019, 8:0