Dissertação
Development of a bacterial model for the production of functional human drug metabolizing enzymes EVALUATED
A hepatoxicidade é a principal causa da rejeição de fármacos durante ensaios clínicos e pode levar à remoção do mercado de fármacos já aprovados. A bioativação de fármacos pela ação de enzimas de fase I e II, nomeadamente citocromos P450 (CYP450s) e sulfotransferases (SULTs), respetivamente, está diretamente relacionada com a formação de metabolitos tóxicos. Neste trabalho, pretendeu-se desenvolver um modelo bacteriano para a produção de CYP450s e SULTs humanas para posteriormente prever a produção de metabolitos tóxicos por ação destas enzimas e assim proporcionar fármacos mais seguros aos pacientes. Os genes que codificam para enzimas metabólicas foram subclonados em sistemas de expressão E. coli-pET. As enzimas CYP2C8 e SULT1B1 foram selecionadas para sobreexpressão e purificação. Ambas as proteínas foram purificadas por cromatografias de afinidade por iões metálicos imobilizados e de exclusão molecular. Os parâmetros cinéticos da enzima SULT1B1 foram caracterizados usando ensaios de sulfonação do 2-naftol e diversos substratos, particularmente, resorcina, fenol e quercetina. Posteriormente, para obter resultados sobre a atividade metabólica das duas enzimas a SULT1B1 foi incubada com resorcinol e o CYP2C8 foi incubado com nevirapine e tamoxifeno. Analisando os resultados obtidos por LC/MS, foram observados metabolitos sulfonados do resorcinol pela SULT1B1 e metabolitos da nevirapina (hidroxi-nevirapina) e do tamoxifeno (N-desmetil-tamoxifeno, N,N-didesmetil-tamoxifeno e hidroxi-tamoxifeno) por oxidação pelo CYP2C8 indicando assim que ambas as proteínas mantém a atividade metabólica descrita. No geral, os resultados sugerem que o modelo bacteriano é um método promissor para testar fármacos novos ou já aprovados de modo a evitar riscos no quotidiano dos pacientes.
novembro 7, 2018, 14:0
Publicação
Obra sujeita a Direitos de Autor
Orientação
ORIENTADOR
Maria Matilde Soares Duarte Marques
Departamento de Engenharia Química (DEQ)
Professor Catedrático
