Dissertação
OmpK antigenic peptide from Vibrio alginolyticus in recombinant Escherichia coli - production and secretion challenges EVALUATED
Lpp é a lipoproteína de Braun responsável pela ligação entre o peptidoglicano e a membrana externa à qual defeitos estruturais podem resultar numa melhoria da secreção de proteínas. Neste trabalho, uma estirpe de E. coli BL21 (DE3) com produção da sequência antisense lpp foi construída e o efeito na permeabilidade celular foi avaliado. Adicionalmente, otimização da sobreexpressão do fragmento OmpK 21-99 de Vibrio alginolyticus foi realizada, e a estirpe desenvolvida usada como hospedeira para observar o impacto na localização do péptido. Os níveis de mRNA de lpp foram avaliados por RT-PCR, permitindo a observação de uma diminuição na expressão do transcrito 2h após a indução da expressão do antisense. No entanto, 1,5h depois ocorre uma perda do efeito do antisense, devido ao desaparecimento das células com expressão antisense. Monitorização do crescimento de E. coli demonstrou um maior crescimento na cultura wild-type comparativamente às culturas pMLBAD ou pSAS39, indicando que a presença do plasmídeo é a causa principal para as diferenças nos crescimentos. Sobreexpressão do fragmento OmpK 21-99 foi verificada com sucesso a 30ºC, embora não se tenha comprovado a localização periplasmática nem a secreção para o meio extracelular, o que poderá estar relacionado com problemas no processo de deteção. A avaliação da permeabilidade das células sob efeito do antisense e a análise de RT-PCR demonstraram resultados promissores, apesar de alguns aspetos ainda precisarem de ser melhor estudados. Sobreexpressão do fragmento OmpK foi confirmada ao contrário da localização periplasmática e citoplasmática, o que significa que as metodologias terão de ser melhoradas.
novembro 29, 2021, 14:0
Publicação
Obra sujeita a Direitos de Autor
Orientação
ORIENTADOR
Sílvia Andreia Bento da Silva Sousa Barbosa
Departamento de Bioengenharia (DBE)
Professor Auxiliar Convidado