Dissertação
Lactic acid bacteria as producers of pharmaceutical-grade molecules: genetic engineering tools for improvement of Lactococcus lactis strains EVALUATED
As bactérias ácido lácticas (LAB) são uma ferramenta promissora para a produção de DNA e proteínas de grau farmacêutico ou como vetores para libertação destas moléculas in vivo. A necessidade de estirpes otimizadas para estas aplicações tornam essencial descobrir estratégias para edição genómica em LAB. Duas abordagens baseadas em recombineering (acoplado ou não a um sistema CRISPR-Cas9) foram otimizadas para inativar o gene nth (endonuclease) no genoma de Lactococcus lactis LMG19460. Na estratégia Reisch & Prather, foram clonados a origem de replicação pAMβ1 e o gene de resistência a eritromicina no plasmídeo com o gene Cas9 e o sgRNA para nth foi introduzido no plasmídeo que contém os genes λ-Red. No entanto, o primeiro plasmídeo (pCas9cr4) sofreu alterações após transformação em L. lactis e, assim, o segundo (pKDsgRNA-nth) não foi introduzido nas células. Na estratégia de Datsenko & Wanner, o plasmídeo com os genes λ-Red (pKD46) foi introduzido na estirpe com sucesso. A integração da cassete de resistência a canamicina na região do gene nth, não foi alcançada. A dificuldade desta estirpe em crescer com L-arabinose como única fonte de carbono, torna difícil a indução de expressão das proteínas λ-Red. Adicionalmente, L. lactis LMG19460 tem elevada resistência a canamicina, tornando a seleção de transformantes complicada. Apesar dos passos de otimização alcançados, dado que a estirpe tem uma elevada taxa de degradação de DNA exógeno, é provável que os plasmídeos e DNA linear não se mantenham estáveis na célula tempo suficiente para que a estratégia seja aplicada.
novembro 15, 2019, 14:30
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