Dissertação
Reverse lipofection for spatially defined transfection with DNA/cationic lipoplexes EVALUATED
Apesar de as terapias génicas serem consideradas para fins terapêuticos, a entrada do gene no núcleo é a maior barreira a uma eficiente transfeção celular. Em detrimento do uso de métodos virais, surgiram os métodos não virais de entrega de genes e o uso de materiais para o empacotamento do ADN tais como lípidos catiónicos são atualmente considerados métodos cruciais para a entrega e proteção dos genes de, por exemplo, nucleases e outras barreiras dentro da célula. Assim, no presente trabalho propõe-se um novo método de transfeção reversa que poderá combinar as vantagens do uso de lípidos catiónicos com tecnologias de matrizes celulares. Neste novo método, os lipoplexos são imobilizados no substrato, antes da colocação das células, através da ligação avidina-biotina. Numa primeira abordagem, a imobilização dos lipoplexos foi testada e realizados vários ensaios exploratórios. De seguida, através de Métodos de Superfície de Resposta (MSR), foram variadas cinco variáveis (concentração de lípidos, proporção DOTAP:DOPE, número inicial de células, concentração de pADN e tamanho do lipossoma) conhecidas por influenciar a eficiência de transfeção. Desta forma, não só se obteve o efeito de cada variável como também o efeito da interação entre variáveis na eficiência de transfeção. Obteve-se uma transfeção máxima de 63,3% e observou-se que a proporção DOTAP:DOPE e a concentração de lípido foram as variáveis com mais efeito na eficiência transfeção. Apesar de se concluir que a região experimental sob estudo estava deslocada da região ideal para uma transfeção ótima, experiências futuras poderão ser desenhadas através das conclusões aqui retiradas.
dezembro 1, 2015, 16:30
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