Dissertação

Novel Strategies for gene manipulation in mammalian cells EVALUATED

O projecto descrito nesta tese consistiu na modificação de dois Cromossomas Artificiais Bacterianos (Bacterial Artificial Chromosomes, BACs), um contendo uma inserção com o gene Delta-like-1 (Dll1) do rato e outro com o gene Delta-like-4 (Dll4), tal como as sequencias genómicas que os rodeiam nos respectivos cromossomas. As modificações foram introduzidas para substituir estes genes pela enzima Cre recombinase. As construções obtidas serão posteriormente utilizadas para a geração de linhas transgéncias de rato, por pró-injecção nuclear. Nestas linhas espera-se que a enzima Cre seja expressa exactamente nas mesmas células que expressam o gene endógeno. Assim, seria possível desenvolver uma estratégia para traçar um mapa genético (Genetic Fate Mapping) que permita seguir o destino das células que expressam Dll1 ou Dll4. Para modificar os BACs, foi utilizada a tecnologia de Recombineering, que permite efectuar de forma eficiente eventos de recombinação homóloga em E. coli. Em particular foi utilizado o sistema Red, codificado pelo profago  incompleto. Este sistema está presente na estirpe SW105 de E. coli, que teve de ser transformada, por electroporação, com os BACs. Foram construídos e utilizados vectores com a enzima Cre flanqueada por regiões de homologia para os genes Dll1 e Dll4, de forma a recombinarem com os respectivos BACs em células SW105. Os BACs foram inseridos com sucesso nestas células e foram obtidos recombinantes, no entanto, o método de verificação dos resultados ainda não permitiu uma conclusão definitiva sobre a experiência. São propostas alternativas para a identificação, com sucesso, de recombinantes correctos.
Sinalização Notch; Dll1; Dll4; Cromossoma Artificial Bacteriano (BAC); Mapa genético do

Setembro 4, 2007, 11:0

Publicação

Obra sujeita a Direitos de Autor

Orientação

CO-ORIENTADOR

Domingos Manuel Pinto Henrique

Instituto de Medicina Molecular , F. Medicina Lx, Unidade de Biologia do Desenvolvimento

Especialista

ORIENTADOR

Joaquim Manuel Sampaio Cabral

Departamento de Engenharia Química e Biológica (DEQB)

Professor Catedrático